Wedi'i olygu gan Peter Sarnow, Ysgol Feddygaeth Prifysgol Stanford, Prifysgol Stanford, California, a gymeradwywyd ar Rhagfyr 25, 2020 (adolygwyd ar Hydref 25, 2020)
Rydym yn adrodd ar y rhyngweithio rhwng is-unedau wrth ddyblygu coronafirysau-cyfadeiladau trawsgrifio, sy'n hanfodol ar gyfer atgynhyrchu a chadwraeth esblygiadol.Fe wnaethom ddarparu tystiolaeth bod gan y parth NiRAN sy'n gysylltiedig ag nsp12 weithgaredd transferase monoffosffad niwcleosid (NMP) mewn traws, a nodwyd nsp9 (protein sy'n rhwymo RNA) fel ei darged.Mae NiRAN yn cataleiddio ymlyniad cofalent y moiety NMP i'r terfynfa amino nsp9 cadw mewn adwaith sy'n dibynnu ar ïonau Mn2+ a gweddillion Asn cadw cyfagos.Canfuwyd bod gweithgaredd NiRAN ac nsp9 NMPylation yn hanfodol ar gyfer dyblygu coronafirws.Mae'r data yn ein galluogi i gysylltu'r gweithgaredd hwn o'r marciwr ensym firws nythu â'r arsylwadau blaenorol yn y ddamcaniaeth bod cychwyn synthesis RNA mewn dosbarth o firysau RNA yn gyson yn swyddogaethol ac yn esblygiadol.
Mae'r polymeras RNA-dibynnol RNA (RdRps) o Nidovirales (Coronaviridae, Arterioviridae, a 12 teulu arall) yn gysylltiedig â'r parth amino-terminal (N-terminal) yn y protein anstrwythurol (nsp) a ryddhawyd o'r polyprotein, a elwir yn NiRAN Mae 1ab yn cynnwys prif broteas firaol (Mpro).Yn flaenorol, adroddwyd am weithgaredd GMPylation / UMPylation firws prifwythiennol NiRAN-RdRp nsp ei hun, ac awgrymwyd cynhyrchu dros dro ar gyfer trosglwyddo monoffosffad niwcleosid (NMP) i'r firws (anhysbys ar hyn o bryd) a / neu fiopolymerization celloedd Pethau.Yma, rydym yn dangos bod gan y coronafirws (Coronafeirws Dynol [HCoV]-229E a Coronafeirws Syndrom Anadlol Acíwt Difrifol 2) nsp12 (NiRAN-RdRp) weithgaredd NMPylation Mn2+-ddibynnol, sy'n deillio o nsp9 trwy ffurfio nsp9 wedi'i gyfryngu gan Mpro mae'r nsps ystlys N-terfynell yn cael ei ryddhau'n broteolytaidd, mae'r ffosfforamidad wedi'i fondio i'r amin cynradd (N3825) ar derfynell N nsp9.Uridine triphosphate yw'r niwcleotid a ffefrir yn yr adwaith hwn, ond mae adenosine triphosphate, guanosine triphosphate, a cytidine triphosphate hefyd yn gyd-swbstradau addas.Penderfynodd astudiaethau treiglo gan ddefnyddio proteinau coronafirws ailgyfunol nsp9 ac nsp12 a mutants HCoV-229E wedi'u peiriannu'n enetig y gweddillion angenrheidiol ar gyfer NMPylation nsp9 wedi'i gyfryngu gan NiRAN ac atgynhyrchu firws mewn diwylliant celloedd.Cadarnhaodd y data ragfynegiad o weddillion safle gweithredol NiRAN a phenderfynwyd rôl bwysig gweddillion nsp9 N3826 yn nsp9 NMPylation ac atgynhyrchu firws in vitro.Mae'r gweddillion hwn yn rhan o'r dilyniant tripeptide NNE NNE gwarchodedig a phrofodd i fod yr unig weddillion amrywiol o nsp9 a'i homologau yn y teulu coronafirws.Mae'r astudiaeth hon yn darparu sylfaen gadarn ar gyfer astudiaeth swyddogaethol o weithgaredd NMPylation o firysau nythu eraill ac yn cynnig targedau posibl ar gyfer datblygu cyffuriau gwrthfeirysol.
Nidovirales positif-sownd RNA firws heintio amrywiaeth o fertebratau ac infertebratau (1, 2).Ar hyn o bryd mae'r gorchymyn yn cynnwys 14 teulu (3), ac mae'r teulu Coronavirus wedi cael ei astudio'n helaeth yn ystod yr 20 mlynedd diwethaf.Bryd hynny, daeth tri coronafirws milheintiol i'r amlwg o westeion anifeiliaid ac achosi achosion ar raddfa fawr o heintiau anadlol difrifol mewn pobl.Gan gynnwys pandemigau parhaus a achosir gan glefydau heintus acíwt difrifol.Coronafeirws Syndrom Anadlol 2 (SARS-CoV-2) (4ââ7).Mae Nidoviruses yn rhannu sefydliad genom cyffredin, ac mae is-uned y cyfadeilad atgynhyrchu-trawsgrifio (RTC) wedi'i rwymo â philen wedi'i amgodio yn y 5-²-terminal dwy ran o dair a phrif is-uned strwythurol y gronyn firws, yn ogystal â rhai ategolion. .Protein, wedi'i amgodio yn y trydydd pen 3??² o'r genom (1).Ac eithrio un teulu o firysau planaraidd (Monoviridae) (8), mae pob firws nythu yn amgodio is-unedau RTC mewn dwy ffrâm ddarllen agored fawr (ORF) ORF1a ac ORF1b, sy'n cael eu cyfieithu o RNA genomig o.Mae ORF1a yn amgodio polyprotein (pp) 1a, ac mae ORF1a ac ORF1b yn amgodio pp1ab ar y cyd.Gyda chyfranogiad cyffredinol y prif broteas (Mpro) wedi'i amgodio gan ORF1a, mae pp1a a pp1ab yn cael eu prosesu'n broteolytaidd i amrywiaeth o broteinau anstrwythurol (nsps), a elwir hefyd yn 3CLpro, oherwydd bod ganddo homoleg â 3Cpro y picornavirus ( 9).Credir bod y nsps hyn yn cael eu cydosod yn RTC deinamig mawr, yn cataleiddio synthesis RNA genomig (dyblygiad) a set o RNA subgenomig (trawsgrifio), ac yn cael eu defnyddio i gydlynu mynegiant yr ORF sydd wedi'i leoli i lawr yr afon o ORF1b (10 ? ? ?12).
Mae'r RTC craidd yn cynnwys RNA polymeras RNA-ddibynnol (RdRp) (13), helicase superfamily 1 (HEL1) (14, 15) a nifer o ensymau prosesu RNA, sydd wedi'u hamgodio'n bennaf yn ORF1b ac yn y teulu coronafirws Mae'n cynnwys nsp12-nsp16 a nsp9-nsp12 yn y teulu Arterioviridae (gweler cyfeiriad 10â 12).Mae RdRp a HEL1 yn cynrychioli dau (un rhan o bump) o barthau gwarchodedig firws nyth yr aderyn ac mae ganddynt homoleg ymhlith firysau RNA eraill.Credir bod atgynhyrchiad craidd yn cael ei gynorthwyo gan is-unedau eraill, gan gynnwys sawl nsps bach a ryddhawyd o ranbarth carboxy-terminal (C-terminal) o pp1a, i lawr yr afon o Mpro (coronafeirws nsp5 a firws arterial nsp4, yn y drefn honno).Mae ganddynt warchodaeth teulu-benodol cyfyngedig a gweithgareddau amrywiol (a adolygir yng nghyfeirnod 10ââ12).
Yn gymharol ddiweddar, canfuwyd parth gyda nodweddion motiff dilyniant unigryw yn y derfynfa amino (N-terminus) ger RdRp ym mhob firws nythu, ond dim firysau RNA eraill (16).Yn seiliedig ar ei leoliad a gweithgaredd transferase niwcleotid (nucleoside monophosphate [NMP] transferase), enwir y parth hwn yn NiRAN (Nestvirus RdRp-related nucleotide transferase).Mae'r cyfuniad parth deuol o NiRAN-RdRp yn cynnwys nsp12 yn y teulu Coronaviridae ac nsp9 yn y teulu Arterioviridae, ac mewn nestoviridae eraill, disgwylir i NiRAN-RdRp gael ei ryddhau fel nsp annibynnol o'r polyprotein firaol.Yn y coronafirws, mae parth NiRAN yn cynnwys ??1/450 o weddillion ac mae wedi'i gysylltu â pharth C-terminal RdRp trwy'r rhanbarth cysylltu (16?19).Mewn Feirws Arteritis Ceffylau (EAV) (Arteriviridae), mae nsp9 ailgyfunol yn dangos gweithgareddau UMPylation a GMPylation ïon-ddibynnol (hunan) Mn2+, sy'n dibynnu ar dri sylfaen dilyniant cadw mewn nestofeirws, AN, BN a CN Y gweddillion yn y dilyniant.Lle mae N yn sefyll am NiRAN) (16).Mae ochr N-derfynell y motiffau hyn yn preAN motiff llai ceidwadol.Mae rhai o'r gweddillion hyn hefyd yn cael eu cadw mewn kinases protein cysylltiedig bell, lle maent wedi cael eu dangos i fod yn rhan o niwcleosid triphosphate (NTP) rhwymo a gweithgaredd catalytig (20, 21).Yn gyson â'r arsylwi hwn, gellir cydosod nifer o weddillion safle gweithredol allweddol yn y pseudokinase SelO o Pseudomonas syringae gyda'r supercomplex SARS-CoV-2 nsp7/8/12/13 a gyhoeddwyd yn ddiweddar.Gweddillion NiRAN Coronafirws wedi'u cadw wedi'u harosod yn y microstrwythur electronau.Protein ailgyfunol (17).Tybir y bydd yr U / GMPylation dogfenedig (hunan) yn cynhyrchu cyflwr dros dro i drosglwyddo NMP i'r swbstrad (anhysbys ar hyn o bryd) (16), a'r tebygrwydd strwythurol rhwng NiRAN a protein kinase (17, 19) ) Ai'r ddamcaniaeth yw bod Mae NiRAN yn addasu proteinau eraill.
Mae llawer o nodweddion, gan gynnwys ei gysylltiad systematig unigryw ac unigryw â firysau nythu a gwahaniad genetig oddi wrth RdRp, yn gwneud NiRAN yn ensym rheoleiddio allweddol rhesymol ar gyfer firysau nythu, sy'n hanfodol i'w hymddangosiad a'u hunaniaeth.Yn flaenorol, galwyd tair swyddogaeth bosibl yn ymwneud â NiRAN i reoleiddio cyfieithu genom / isgenomig neu atgynhyrchu / trawsgrifio.Wrth ystyried y data prin ac anghyflawn oedd ar gael ar y pryd, mae gan bob swyddogaeth ei fanteision a'i hanfanteision (16).Yn yr ymchwil hwn, ein nod yw cyfuno astudiaethau biocemegol a genetig gwrthdro'r coronafirysau sy'n cynrychioli'r ddau genynnau, a rhoi ein canfyddiadau yng nghefndir esblygiadol treiglad naturiol y teulu coronafirws, er mwyn cael mewnwelediad i'r deyrnas Ddirgel hon.Rydym yn adrodd am ddatblygiadau mawr yn nealltwriaeth NiRAN trwy nodi targedau naturiol yn RTC, sydd (ymhlith y tair rhagdybiaeth sydd ar gael) yn cyfrannu at rôl y maes hwn wrth gychwyn y synthesis o RNA firws nythu.Mae'r ymchwil hwn hefyd yn agor posibiliadau ar gyfer rolau eraill NiRAN ar y rhyngwyneb gwesteiwr firws.
Er mwyn nodweddu priodweddau ensymatig y parth NiRAN sy'n gysylltiedig â firws corona nsp12, cynhyrchwyd ffurf ailgyfunol o coronafirws dynol 229E (HCoV-229E) nsp12 yn E. coli, gyda thag His6 yn y C-terminus, a chyfunwyd y protein gyda [α32-P ] Deor ynghyd â NTP ym mhresenoldeb MnCl2 fel y disgrifir yn Deunyddiau a Dulliau.Roedd y dadansoddiad o'r cynnyrch adwaith yn nodi presenoldeb protein radiolabel yn ymfudo ar y cyd ag nsp12 (106 kDa), sy'n nodi bod coronafirws nsp12 yn cataleiddio ffurfio adion protein-NMP cofalent, wedi'i ffurfio'n ffafriol â monoffosffad wridin (UMP) (Ffigur 1A) A B).Dangosodd dadansoddiad meintiol, o gymharu â niwcleotidau eraill, fod dwyster signal ymgorfforiad UMP wedi cynyddu 2 i 3 gwaith (Ffigur 1C).Mae'r data hwn yn gyson â'r gweithgaredd trosglwyddo NMP a ragwelir ym mharth NiRAN y coronafirws (16), ond mae'n nodi bod dewisiadau niwcleotid parth NiRAN y coronafirws a'r firws rhydwelïol yn wahanol.
Gweithgaredd hunan-NMPylation o HCoV-229E nsp12.(A) Cafodd HCoV-229E nsp12-His6 (106 kDa) ei ddeor gyda'r NTP dynodedig [α-32P] ym mhresenoldeb 6 mM MnCl2 am 30 munud (gweler Deunyddiau a Dulliau am fanylion).Gwahanwyd y cynhyrchion adwaith gan SDS-PAGE a'u staenio â glas gwych Coomassie.(B) Mae'r protein â label radio yn cael ei ddelweddu gan ddelweddu ffosfforws.Dangosir safleoedd nsp12-His6 a marcwyr màs moleciwlaidd protein (mewn kilodaltonau) yn A a B. (C) Pennwyd dwyster y signal ymbelydrol (cymedr ± SEM) o dri arbrawf annibynnol.*P≤0.05.Mae cryfder y signal (canran) yn gysylltiedig ag UTP.
Er y dangoswyd bod gweithgareddau ensymau sy'n gysylltiedig â NiRAN yn hanfodol ar gyfer dyblygu EAV a SARS-CoV mewn diwylliant celloedd (16), nid yw swyddogaeth benodol NiRAN a thargedau posibl wedi'u pennu eto.Fe wnaeth y tebygrwydd strwythurol a adroddwyd yn ddiweddar rhwng NiRAN a theulu o broteinau â phlygiadau tebyg i kinase protein (17, 22) ein hysgogi i brofi'r ddamcaniaeth bod NiRAN yn cataleiddio NMPylation proteinau eraill.Cynhyrchwyd set o dargedau homologaidd posibl gennym, gan gynnwys proteinau anstrwythurol wedi'u hamgodio gan HCoV-229E ORF1a (nsps 5, 7, 8, 9, 10), pob un yn cynnwys tag C-terminal His6 (atodiad SI, Tabl S1), Ac deorwch y proteinau hyn â [α32-P] wridin triphosphate ([α32-P]UTP) ym mhresenoldeb neu absenoldeb nsp12.Roedd albwmin serwm buchol a phrotein ymasiad MBP-LacZα a gynhyrchwyd yn E. coli yn gweithredu fel rheolyddion (Ffigur 2A, lonydd 1 i 7).Dadansoddwyd y protein wedi'i labelu â radio gan electrofforesis gel sodiwm dodecyl sylffad-polyacrylamid (SDS-PAGE) ac awtoradiograffeg, a chanfuwyd bod signal ymbelydrol cryf yn yr adwaith sy'n cynnwys nsp12 ac nsp9.Mae lleoliad y signal yn cyfateb i fàs moleciwlaidd nsp9, gan nodi UMPylation nsp12-mediated o nsp9 (Ffigur 2B, trac 7).Ni chanfuwyd bod unrhyw broteinau prawf eraill wedi'u UMPylated, a arweiniodd at ddod i'r casgliad bod nsp9 yn swbstrad penodol o nsp12.Yn gyson â'r data hunan-NMPylation a ddangosir yn Ffigur 1, mae nsp12 yn gallu trosglwyddo'r pedwar NMP i nsp9, er bod yr effeithlonrwydd yn wahanol, UMP> adenosine monophosphate (AMP)> guanosine monophosphate (GMP)> cytidine monophosphate (CMP)) ( Llun).3 A a B).O dan yr amodau a ddefnyddir yn y assay hwn (cwtogi'r amser adwaith ac amlygiad, lleihau'r crynodiad o nsp12; deunyddiau a dulliau), ni ellid canfod hunan-NMPylation nsp12 (cymharer Ffigur 2B, lôn 7, a Ffigur 1B), sy'n profi'n UMP effeithiol (A rowndiau lluosog) symud o nsp12 i nsp9.Mae gweithgaredd trosglwyddo UMP yn gofyn am bresenoldeb ïonau Mn2+, fel y dangosir yn Ffigur 3C, tra mai dim ond ychydig iawn o weithgarwch trosglwyddo UMP a welwyd ym mhresenoldeb Mg2+, ac ni welwyd unrhyw weithgaredd ym mhresenoldeb y ddau gatasiwn deufalent arall a brofwyd.Cafwyd data tebyg mewn profion NMPylation sy'n cynnwys cytidine triphosphate (CTP), triphosphate guanosine (GTP), ac adenosine triphosphate (ATP) (Atodiad SI, Ffigur S1).
HCoV-229E nsp12-mediated UMPylation o nsp9.Defnyddiwyd cyfres o swbstradau protein (gan gynnwys albwmin serwm buchol, MBP-lacZα, a chyfres o nsps HCoV-229E wedi'u labelu â C-terminal His6 wedi'u hamgodio gan ORF1a) i werthuso gweithgaredd UMPylation HCoV-229E nsp12-His6⁺-mediated protein.Deorwch y protein gyda [α-32P] UTP am 10 munud yn absenoldeb (A) neu bresenoldeb (B) nsp12 fel y disgrifir yn y deunyddiau a'r dulliau.Ar frig A a B, dangosir gel SDS-polyacrylamid wedi'i staenio â Coomassie Brilliant Blue, ac ar waelod A a B, dangosir yr autoradiogramau cyfatebol.Rhoddir lleoliad marciwr màs moleciwlaidd y protein (mewn kilodaltonau) ar y chwith.Mae lleoliad nsp12-His6 (B, top) a'r signal ymbelydrol a welwyd yn ystod deori nsp12-His6 gyda nsp9-His6 (B, lôn 7) hefyd wedi'u nodi, sy'n nodi bod [α-32P]UMP i nsp9-His6 (12.9 kDa), na welwyd ar gyfer proteinau eraill a brofwyd.
HCoV-229E NiRAN-gyfryngol nodweddu biocemegol a firolegol o nsp9 NMPylation.(A a B) Rôl y cyd-swbstrad niwcleotid a ddefnyddir yn yr adwaith.Mae Nsp12-His6 ac nsp9-His6 yn gymysg ac yn cael eu deori ym mhresenoldeb gwahanol NTPs [α-32P] yn y assay NMPylation safonol.(A, top) Coomassie-staen nsp9-His6 gwahanu gan SDS-TUDALEN.(A, gwaelod) Autoradiograff o'r un ardal o'r gel.(B) Mae'r gweithgaredd cymharol (cymedr ± SEM) ym mhresenoldeb y cofactor niwcleotid dynodedig yn cael ei bennu o dri arbrawf annibynnol.*P≤0.05.(C) Rôl ïonau metel.Dangosir y prawf NMPylation safonol ym mhresenoldeb [α-32P] UTP a gwahanol ïonau metel, pob un â chrynodiad o 1 mM.Yn C, dangosir y brig, staen Coomassie nsp9-His6, ac yn C, y gwaelod, dangosir yr awtoradiograffeg cyfatebol.Dangosir maint y protein wedi'i labelu (mewn cilodaltonau) i'r chwith o A ac C. (D) Mae ffurf mutant HCoV-229E nsp12-His6 sy'n cario'r amnewidiad asid amino penodedig yn [α-32P]UTP, fel y disgrifir mewn Defnyddiau a Dulliau.Mae'r radiolabeled nsp9-His6 a gynhyrchir yn yr adwaith NMPylation yn cael ei ganfod gan ddelweddu ffosfforyleiddiad (D, top).Dangosir y gweithgaredd cymharol o'i gymharu â'r protein math gwyllt (wt) yn D, a chymerir y gwaelod fel y cyfartaledd (±SEM) o dri arbrawf annibynnol.Mae seren yn dynodi amnewidion gweddillion heb eu cadw.(E) Mae'r titer firws yn uwchnatur diwylliant celloedd p1 a gafwyd 24 awr ar ôl haint yn cael ei bennu gan assay plac.Nodir amnewidiadau codon ym mharth NiRAN o'r mwtant HCoV-229E peirianyddol (mae rhifo'r gweddillion yn seiliedig ar eu safle yn pp1ab).Defnyddiwyd y mutant safle gweithredol RdRp atgynhyrchu-ddiffygiol nsp12_DD4823/4AA fel rheolydd.
Er mwyn cael dealltwriaeth ddyfnach o safle gweithredol NiRAN a phennu'r gweddillion sy'n gysylltiedig â gweithgaredd transferase NMP penodol i nsp9, gwnaethom ddadansoddi treiglad, lle gwnaethom ddisodli'r gweddillion ceidwadol ym motiffau NiRAN AN, BN a CN ( 16) Ala yw hi (Atodiad SI, Ffigur S2).Yn ogystal, gwerthuswyd effaith dirprwyon ceidwadol Arg-to-Lys neu Lys-i-Arg mewn dau achos.Fel rheolaeth (negyddol), mae gweddillion nad ydynt yn cael eu cadw neu lai ym mharth NiRAN coronafirysau a firysau nythu eraill yn cael eu disodli gan Ala. Yn lle K4116A (mewn motif preAN), K4135A (AN), R4178A (BN), D4188A (motiff Mae BN) a D4280A (CN) yn lleihau'n sylweddol neu hyd yn oed yn dileu NMPylation nsp9 trwy nsp12, tra bod proteinau ag amnewidion ceidwadol (R4178K), K4116R) yn cadw 60% ac 80% o'u gweithgaredd, sy'n dangos bod llacio'r cyfyngiadau ar eu hochr priodol cadwyni yn ffisigocemegol sensitif (Ffigur 3D).Mae disodli nifer o weddillion cadw eraill E4145A, D4273A, F4281A a D4283A yn llawer llai niweidiol, ac mae UMPylation nsp9 ond yn lleihau'n gymedrol.Cafwyd canlyniadau tebyg mewn adweithiau NMPylation nsp9 yn cynnwys NTPs eraill (Ffigur 3D ac atodiad SI, Ffigur S3), gan gadarnhau bod yr effeithiau a welwyd ar amnewidiadau asid amino penodol yn annibynnol ar y math o gyd-swbstrad niwcleotid a ddefnyddir.Nesaf, gwnaethom brofi effaith bosibl yr amnewidion nsp12 hyn ar ddyblygu coronafirysau mewn diwylliant celloedd.I'r perwyl hwn, gwnaethom ddefnyddio templedi DNA cyflenwol priodol wedi'u peiriannu'n enetig (cDNA) wedi'u clonio mewn firws vaccinia ailgyfunol (23, 24) i drawsgrifio 5 -7 celloedd.Dangosodd titradiad epil firws heintus a gynhyrchwyd yn y celloedd hyn nad oedd y rhan fwyaf o mutants NiRAN HCoV-229E yn ymarferol (Ffigur 3E).Mae grŵp o mutants firaol anhyfyw yn cynnwys dewisiadau amgen y dangoswyd eu bod yn dileu neu'n lleihau'n sylweddol weithgaredd NMP transferase in vitro (K4116A, K4135A, R4178A, D4188A, D4280A, D4283A), ond mae dau ddewis arall (K4116R, E4145A) 8 % wedi'i gadw?Mae eu gweithgaredd NMPylation in vitro yn awgrymu bod cyfyngiadau ychwanegol ynghlwm.Yn yr un modd, cynhyrchodd dau dreiglad arall (R4178K, F4281A) a achosodd ostyngiad cymedrol yng ngweithgaredd NMPylation in vitro NiRAN firysau byw, fodd bynnag, gostyngodd y firysau hyn titers yn sylweddol trwy ddyblygiad.Yn gyson â'r data gweithgaredd in vitro a ddangosir yn Ffigur 3D, gan ddisodli pedwar gweddillion eraill nad ydynt wedi'u cadw mewn coronafeirws a/neu firysau nythu eraill (K4113A, D4180A, D4197A, D4273A) (8, 16) cynhyrchodd firysau hyfyw yr epil, er bod ganddynt titer cymedrol is o'i gymharu â'r firws tebyg i wyllt (Ffigur 3E).
Er mwyn astudio a yw gweithgaredd trosglwyddiadase NMP wedi'i gyfryngu gan NiRAN yn dibynnu ar y parth RdRp gweithredol, disodlwyd y ddau weddillion Asp gwarchodedig sy'n ymwneud â chydlynu ïonau metel deufalent (11) ym motiff RdRp C gan Ala. Mae'r protein canlyniadol nsp12_DD4823/4AA yn cadw ei weithgaredd NMPylation nsp9, sy'n nodi nad oes angen gweithgaredd polymeras ar weithgaredd NMPylation nsp12-mediated in vitro nsp9 ( OS Atodiad, Ffigur S4).
Ar ôl sefydlu'r gweithgaredd transferase NMP penodol nsp9 ar gyfer nsp12, rydym yn ceisio nodweddu'r NMP-nsp9 adduct gan sbectrometreg màs (MS).Dangosodd sbectrwm màs protein cyflawn HCoV-229E nsp9 ailgyfunol uchafbwynt o 12,045 Da (Ffigur 4A).Ni newidiodd ychwanegu nsp12 ansawdd nsp9, gan ddangos na fyddai nsp12 ac nsp9 yn ffurfio cyfadeilad sefydlog o dan yr amodau a ddefnyddiwyd (dadnatureiddio) (Ffigur 4A).Ym mhresenoldeb UTP a GTP, dangosodd mesuriad màs yr adwaith sy'n cynnwys nsp9 ac nsp12 yn y drefn honno fod màs protein UTP wedi symud 306 Da, a bod màs protein GTP wedi symud 345 Da, gan nodi bod pob moleciwl nsp9 yn rhwymo UMP neu GMP (Llun 4) C a D).Tybir bod yr ynni sydd ei angen ar gyfer nsp9 NMPylation cyfryngol NiRAN yn dod o hydrolysis NTP a rhyddhau pyroffosffad.Er y defnyddiwyd gormodedd molar 10-plyg o nsp9 (targed) nag nsp12 (ensym) yn yr adwaith hwn, gwelwyd NMPylation o nsp9 bron yn gyflawn, sy'n dangos bod y rhyngweithio rhwng nsp12 ac nsp9 yn fyrhoedlog, a gall nsp12 NMPylu mwy o nsp9 moleciwl in vitro.
NMPylation sengl o nsp9 ym mhresenoldeb nsp12 ac UTP neu GTP.Dangosir y sbectrwm màs protein cyflawn dadunedig o HCoV-229E nsp9 (Atodiad SI, Tabl S1) (AD).(A) nsp9 yn unig, (B) nsp9 + nsp12-His6, (C) nsp9 + nsp12-His6 ym mhresenoldeb UTP, (D) nsp9 + nsp12-His6 ym mhresenoldeb GTP.
Er mwyn pennu'r gweddillion nsp9 UMPylated gan nsp12, nsp9-UMP ei hollti gyda trypsin.Gwahanwyd y peptidau canlyniadol gan gromatograffaeth hylif nano-perfformiad uchel (HPLC) a'u dadansoddi gan sbectrometreg màs tandem (MS/MS) ar-lein.Dangosodd dadansoddiad data gan ddefnyddio pecyn meddalwedd Byonic (Protein Metrics) UMPylation o'r asid amino N-terminal.Cadarnheir hyn â llaw.Datgelodd sbectrwm màs tandem y peptid rhagflaenol [UMP]NNEIMPGK (Atodiad SI, Ffigur S5A) ddarn ar 421 m/z, gan nodi bod UMP yn rhwymo i weddillion 1 o nsp9.
Ar derfynfa N nsp9, cedwir Asn ymhlith aelodau Orthocoronavirinae (Atodiad SI, Ffigur S6).Er ein bod yn credu mai nitrogen amin cynradd terfynell N yw'r derbynnydd mwyaf tebygol ar gyfer UMP, penderfynasom gael tystiolaeth ychwanegol o rwymo NMP yn y derfynell N.Am y rheswm hwn, roedd y peptid N-terminal NMPylated a NMPylated nsp9 puro gan HPLC yn deillio ym mhresenoldeb aseton a sodiwm cyanoborohydride.O dan yr amodau hyn, dim ond aminau cynradd rhad ac am ddim y gellir eu haddasu gyda propyl (25).Mae'r peptid sy'n deillio o N-terminal nsp9 gyda'r dilyniant NNEIMPGK yn cynnwys dau amin cynradd, un yn N-terminus Asn a'r llall wrth gadwyn ochr Lys yn y C-terminus.Felly, gellir cyflwyno grwpiau propyl ar y ddau ben.Dangosir cromatogramau ïon echdynedig peptidau nad ydynt yn NMPylated yn yr atodiad SI, Ffigur S5B.Yn ôl y disgwyl, gellir nodi N-terminal a C-terminal (mono)propylated (Atodiad SI, Ffigur S5B, lôn uchaf) a pheptidau dipropylated (atodiad OS, Ffigur S5B, lôn isaf).Mae'r patrwm hwn yn newid gyda'r defnydd o'r peptid N-terminal NMPylated o nsp9.Yn yr achos hwn, dim ond peptidau propylated C-terminal y gellir eu hadnabod, ond ni nodir peptidau propylated N-terminal a pheptidau dipropylated (OS Atodiad, Ffigur S5C), sy'n nodi bod UMP wedi'i drosglwyddo i'r N-terminal amin cynradd Er mwyn atal hyn grŵp rhag gwneud newidiadau.
Nesaf, rydym yn disodli (gydag Ala neu Ser) neu'n dileu'r gweddillion a gadwyd yn N-terminus nsp9 i ddiffinio cyfyngiadau targed-benodol.Yn seiliedig ar ein data MS sy'n dangos bod NiRAN yn ffurfio adduct nsp9-NMP gyda'r amin sylfaenol o weddillion N-terminal nsp9, gwnaethom ragdybio bod nsp9 NMPylation yn ei gwneud yn ofynnol i'r meistr proteas firaol (Mpro, nsp5) ryddhau terfynell N nsp9 o ei rhagflaenydd polyprotein.I brofi'r rhagdybiaeth hon, cynhyrchwyd rhagflaenydd protein nsp7-11 gennym yn cynnwys nsp9 yn E. coli a pherfformiwyd prawf NMPylation safonol ym mhresenoldeb [α-32P] UTP (deunyddiau a dulliau).Fel y dangosir yn Ffigur 5A (lôn 3), nid yw'r rhagflaenydd nsp7-11 heb ei dorri wedi'i radiolabelu ag nsp12.Mewn cyferbyniad, os yw nsp7-11 yn cael ei hollti gan nsp5 ailgyfunol i ryddhau nsp9 (a nsps eraill) o'r rhagflaenydd, canfyddir protein â label radio sy'n mudo ag nsp9, gan gadarnhau ein casgliad bod NiRAN ac N- Ffurfiant detholus o adwythiadau cofalent nsp9-NMP .Prif amin terfynol yr Asn terfynell N (safle 3825 yn pp1a/pp1ab).Ategir y casgliad hwn hefyd gan arbrofion sy'n defnyddio lluniad nsp9, sy'n cynnwys un neu ddau o weddillion ychwanegol yn y N-terminws.Yn y ddau achos, diddymwyd UMPylation o nsp9 wedi'i gyfryngu gan NiRAN (Atodiad OS, Ffigur S7).Nesaf, gwnaethom gynhyrchu protein gydag un neu ddau o weddillion Asn wedi'u dileu o'r dilyniant peptid 3825-NNEIMPK-3832 yn y derfynell N o nsp9.Yn y ddau achos, rhwystrwyd UMPylation nsp9 yn llwyr (Ffigur 5B), gan ddarparu tystiolaeth ychwanegol bod y terminws nsp9 N go iawn yn gweithredu fel derbynnydd NMP.
Prosesu proteolytig nsp9 a rôl gweddillion N-terminal mewn UMPylation cyfryngol nsp12.(A) nsp9 UMPylation angen terfynell nsp9 N rhad ac am ddim.Mae Nsp7-11-His6 yn cael ei ddeor ymlaen llaw ar 30 ° C mewn byffer canfod NMPylation sy'n cynnwys UTP ym mhresenoldeb neu absenoldeb Mpro ailgyfunol (nsp5-His6).Ar ôl 3 awr, dechreuwch y assay NMPylation trwy ychwanegu nsp12-His6 fel y disgrifir yn Deunyddiau a Dulliau.Defnyddiwyd yr adwaith sy'n cynnwys nsp5-His6 (lôn 1) ac nsp9-His6 (lôn 2) fel rheolydd.Ar ôl 10 munud, terfynwyd yr adwaith a gwahanwyd cymysgedd yr adwaith gan SDS-PAGE.Cafodd y protein ei staenio â Coomassie Brilliant Blue (A, top).Dangosir rhagflaenydd Nsp7-11-His6 a'r cynnyrch wedi'i brosesu sy'n deillio o holltiad cyfryngol nsp5-His6 ar y dde.Sylwch (oherwydd eu maint bach) nad oes modd canfod nsp7 ac nsp11-His6 yn y gel hwn, ac mae'r adwaith yn cael ei ategu gan nsp5-His6 (lonydd 1 a 4; mae lleoliad nsp5-His6 wedi'i nodi gan gylch solet) neu nsp9-His6 (Lôn 2) yn cynnwys swm bach o MBP (a nodir gan gylchoedd agored) fel amhureddau gweddilliol oherwydd eu bod yn cael eu mynegi fel proteinau ymasiad MBP (Atodiad SI, Tabl S1).(B) Nid oes gan yr amrywiad Nsp9-His6 un neu ddau o weddillion Asn terfynell N (gweddillion rhifo yn ôl y sefyllfa yn pp1a/pp1ab) ac mae'n cael ei buro a'i ddeor â nsp12-His6 a [α-32P] UTP.Dangosir B, SDS-TUDALEN wedi'i staenio â Coomassie ar y brig, B, dangosir yr autoradiograff cyfatebol ar y gwaelod.Mae lleoliad y marciwr pwysau moleciwlaidd (mewn kilodaltons) i'w weld ar y chwith.(C) Disodlwyd gweddillion gwarchodedig HCoV-229E nsp9-His6 N ag Ala neu Ser, a defnyddiwyd yr un faint o brotein yn yr adwaith UMPylation cyfryngol nsp12-His6.Gwahanwyd y cynhyrchion adwaith gan SDS-PAGE a'u staenio â Coomassie Brilliant Blue (C, top), a chanfuwyd radiolabeled nsp9-His6 gan ddelweddu ffosfforescence (C, canol).Gan ddefnyddio protein gwyllt-fath (wt) fel cyfeiriad (wedi'i osod i 100%), cyfrifwyd y gweithgaredd NMPylation cymharol (cymedr ± SEM) o dri arbrawf annibynnol.(D) titers firws yn y diwylliant cell p1 supernatant o gelloedd Huh-7 heintio â HCoV-229E math gwyllt celloedd Huh-7, a mutants cario amnewidiadau asid amino dynodedig yn nsp9 eu pennu gan assay plac.Defnyddiwyd y motiff RdRp ail-ddiffyg C dwbl mutant DD4823/4AA fel rheolaeth negyddol.
Mae terfynfa N nsp9 (yn enwedig safleoedd 1, 2, 3, a 6) yn warchodedig iawn ymhlith aelodau is-deulu Orthocoronavirinae (Atodiad SI, Ffigur S6).Er mwyn astudio rôl bosibl y gweddillion hyn yn NMPylation nsp12-mediated nsp9, disodlwyd dau weddillion Asn yn olynol yn N-terminus nsp9 gan Ala neu Ser (yn unig neu mewn cyfuniad).O'i gymharu ag nsp9 math gwyllt, arweiniodd disodli N3825 ag Ala neu Ser at fwy na deublyg o ostyngiad mewn UMPylation cyfryngol nsp12 (Ffigur 5C).Yn gyson â'n casgliad bod NMPylation yn digwydd yn yr amin cynradd N-terminal yn lle cadwyn ochr y gweddillion N-terminal, gwelsom NMPylation gweddilliol sylweddol gyda disodli N3825A a N3825S.Yn ddiddorol, os caiff yr ail Asn ei ddisodli gan Ala neu Ser, mae UMPylation nsp9 yn cael ei leihau'n gryfach (mwy na 10 gwaith), tra bod disodli Ala yn safleoedd 3, 4, a 6 yn cael effaith gymedrol yn unig ar UMPylation nsp9 (Ffigur 2 ).5C).Cafwyd canlyniadau tebyg gan ddefnyddio ATP, CTP neu GTP (Atodiad OS, Ffigur S8).Gyda'i gilydd, mae'r data hyn yn dangos rôl allweddol N2826 (safle 2 yn nsp9) yn NMPylation nsp9.
Er mwyn cael tystiolaeth ychwanegol o'r gydberthynas swyddogaethol rhwng terfynfa N nsp9 ac NMPylation, fe wnaethom berfformio aliniad dilyniant lluosog (MSA) o ddilyniant nsp9 y teulu Coronafeirws (yn amrywio rhwng 104 a 113 o weddillion) (Atodiad OS, Ffigur S6).Yn gyfan gwbl, mewn 47 o rywogaethau (hysbys a thybiedig) o 5 genera o'r is-deulu Orthocoronavirinae sy'n heintio gwahanol famaliaid, adar, a gwesteiwyr ymlusgiaid, dim ond 8 o weddillion i gyd a ganfuwyd yn wahanol.Gwelwyd y newidiadau mwyaf helaeth, gan gynnwys dileadau a mewnosodiadau, yn y cylchoedd rhwng elfennau strwythur eilaidd nsp9, fel y pennwyd gan astudiaethau strwythurol blaenorol (26 ??28).Canfuwyd pum gweddillion amrywiol yn y llinyn β a helix α rhan C-terminal o nsp9.Mae tri gweddillion amrywiol yn ffurfio motiff NNE terfynell N nsp9.Datgelir mai ail Asn y motiff hwn yw'r unig weddillion amrywiadwy, sydd hefyd yn cael ei rannu gan nsp9 damcaniaethol y coronafeirws llyffant pell, ac mae'n cynrychioli rhywogaeth Microhyla letovirus 1 yn yr is-deulu Letovirinae o Alphaletovirus.Gall cadwraeth gweddillion mewn elfennau adeiledd eilaidd nsp9 gael ei resymoli gan ystyriaethau strwythurol i gynnal plygu neu briodweddau rhwymo RNA hysbys.Fodd bynnag, nid yw'n ymddangos bod y rhesymu hwn yn berthnasol i gadwraeth NNE, a chyn yr astudiaeth hon, roedd natur y cyfyngiadau sy'n cyfyngu ar amrywiad y dilyniant tripeptide wedi'i guddio'n llwyr.
Er mwyn pennu pwysigrwydd cadwraeth nsp9-NMPylation ac NNE mewn atgynhyrchu coronafirws, rydym wedi cynhyrchu mutants HCoV-229E, sy'n cario amnewidiadau sengl neu ddwbl o weddillion terfynell N nsp9, sy'n nodi bod NMPylation nsp9 yn niweidiol in vitro.Cyn i ni ddechrau, rydym yn ceisio ateb y cwestiwn a yw'r amnewidiadau hyn (ger safle holltiad nsp8|9) yn effeithio ar brosesu proteolytig rhanbarth C-terminal pp1a.Cynhyrchwyd set o luniadau polyprotein nsp7-11 yn cynnwys amnewidiadau cyfatebol yn N-terminus nsp9 yn E. coli a'u torri â Mpro ailgyfunol.Nid yw holltiadau proteolytig y pedwar safle (gan gynnwys safle ystlysu nsp9) yn cael ei effeithio'n sylweddol gan unrhyw amnewidiadau a gyflwynwyd (Atodiad OS, Ffigur S9), ac eithrio newidiadau strwythurol yn y proteinau hyn sy'n ymyrryd â holltiad Mpro-mediated nsp8|9 (Neu arall) gwefan.
Trawsnewidiwyd celloedd Huh-7 â RNA hyd genom HCoV-229E, gan amgodio amnewidiadau Ala neu Ser yn y tripeptidau NNE gwarchodedig (N3825, N3826, ac E3827) yn y terfynfa nsp9 N, gan ddangos bod y rhan fwyaf o'r treigladau yn angheuol.Roeddem yn gallu achub y firws trwy amnewid y Ser neu Ala o'r N-terminal Asn (N2835A neu N2835S), ond methodd ag adennill y firws gyda threigladau sengl a dwbl eraill yn y dilyniant NNE (N3826A, N3826S, NN3825/6AA, NN3825/6SS) , E3827A) (Ffigur 5D).
Mae'r canlyniadau hyn yn dangos bod atgynhyrchu coronafirysau mewn diwylliant meinwe wedi'i gyfyngu (yr un peth neu debyg), gan gyfyngu ar dreiglad naturiol safleoedd NMPylation nsp9 yn y corff, a chefnogi rôl allweddol yr ymateb hwn yng nghylch bywyd coronafirysau.
Yn y set ddiwethaf o arbrofion, fe wnaethom gynhyrchu terfynell C His6 wedi'i labelu SARS-CoV-2 nsp12 ac nsp9, a dwy ffurf mutant o nsp12 yn E. coli.Roedd y gweddillion safle gweithredol yn y parthau NiRAN a RdRp yn y drefn honno Defnyddiwch Ala yn lle hynny (Ffigur 6A ac atodiad SI, Tabl S2).Mae K4465 yn SARS-CoV-2 nsp12 yn cyfateb i K4135 yn HCoV-229E (Atodiad OS, Ffigur S2), y profwyd ei fod yn ofynnol ar gyfer gweithgaredd NiRAN ac atgynhyrchu HCoV-229E (Ffigur 3D ac E).Mae'r gweddill hwn hefyd yn cyfateb i weddillion firws prifwythiennol EAV nsp9 K94, y dangoswyd yn flaenorol ei fod yn angenrheidiol ar gyfer hunan-UMPylation / hunan-GMPylation NiRAN (16).Fel y dangosir yn Ffigur 6B, mae gan SARS-CoV-2 nsp12 weithgaredd UMP transferase gan ddefnyddio nsp9 fel swbstrad, tra bod y mutant safle gweithredol nsp12_K4465A yn anactif.Nid yw'r amnewid dwbl yn y dilyniant nodweddiadol SDD o motiff C RdRp yn effeithio ar weithgaredd UMP transferase (Ffigur 6B), sy'n nodi nad oes gan weithgaredd RdRp unrhyw effaith uniongyrchol yn UMPylation nsp9.Cafwyd data tebyg gan ddefnyddio CTP, GTP ac ATP (Atodiad SI, Ffigur S10).I grynhoi, mae'r data hyn yn dangos bod gan NMPylation nsp9 wedi'i gyfryngu gan NiRAN weithgaredd ceidwadol mewn coronafirysau sy'n cynrychioli gwahanol genynnau o'r is-deulu orthocoronafeirws.
SARS-CoV-2 nsp12-mediated NMPylation o nsp9.(A) Gel polyacrylamid SDS-staen Coomassie yn dangos y protein ailgyfunol a ddefnyddir yn y prawf NMPylation.Fel rheolaeth, defnyddiwyd protein mutant gydag amnewidiad safle gweithredol ym mharth NiRAN (K4465A) a pharth RdRp (DD5152 / 3AA) o SARS-CoV-2 nsp12.Mae rhifo gweddillion yn seiliedig ar y safle yn pp1ab.(B) Autoradiograff o ganfod UMPylation gan ddefnyddio nsp9-His6 a [α-32P]UTP fel swbstrad nsp12-His6 (math gwyllt [wt] a mutant).Mae màs moleciwlaidd (mewn kilodaltonau) y protein wedi'i labelu i'w weld ar y chwith.
Yn gyffredinol, mae parthau NiRAN yn cael eu cadw yn Nidovirales (16), sy'n nodi eu bod yn cataleiddio adweithiau ensymatig sy'n hanfodol ar gyfer dyblygu Nidovirws.Yn yr astudiaeth hon, roeddem yn gallu profi bod parth NiRAN y coronafirws yn trosglwyddo NMP (a gynhyrchir o NTP) i nsp9, protein rhwymo RNA dirgel sy'n ymwneud ag atgynhyrchu firws (26 ?? 29 ), i'w bennu fel targed naturiol a partner o RTC coronafirws.
Mae parth NiRAN yn rhannu tri motiff dilyniant (AN, BN, a CN), sy'n cynnwys nifer fach iawn o weddillion sy'n cael eu cadw ym mhob teulu yn y drefn Nidovirales monoffyletig ond hynod wahaniaethol (8, 16).Mae astudiaethau diweddar wedi dangos eu bod yn strwythurol gysylltiedig â theulu annodweddedig i raddau helaeth o broteinau tebyg i kinase protein, a elwid yn wreiddiol yn deulu SelO (17, 19, 22, 30, 31).SelO sy'n gysylltiedig â phroteinau wedi plygiadau kinase, ond mae diffyg cadw nifer o weddillion safle gweithredol yn kinases clasurol (22, 32).Yn seiliedig ar gyfeiriadedd cefn moleciwlau ATP wedi'u rhwymo i'r safle gweithredol a'u sefydlogi gan ryngweithiadau penodol, rhagdybiwyd SelO a chadarnhawyd wedyn i drosglwyddo AMP (yn lle ffosffad) i'r swbstrad protein (22), tra bod gan brotein bacteriol arall tebyg i SelO YdiU. dangoswyd yn ddiweddar ei fod yn gataleiddio ymlyniad cofalent UMP i Tyr a'i weddillion o wahanol swbstradau protein (33).
Er mwyn cadarnhau ac ehangu'r rhagfynegiad o weddillion safle gweithredol tybiedig y parth coronafirws NiRAN, gwnaethom ddefnyddio dulliau biocemegol a geneteg gwrthdro i berfformio dadansoddiad treiglo ar y coronafirws nsp12 (Ffigur 3D ac E ac atodiad SI, Ffigur S3 a thabl) S1â S4).Mae'r data'n dangos bod disodli HCoV-229E K4135, R4178 a D4280 ag Ala yn dileu gweithgaredd transferase in vitro NMP a dyblygu firws mewn diwylliant celloedd (ffigur 3D ac atodiadau E ac SI, Ffigur S3), gan gefnogi eu presenoldeb yn NTP γ-ffosffad (K4135, R4178) a chydgysylltu ïonau metel safle gweithredol (D4280).Dangoswyd bod amnewid E4145A y Glu cadw yn ystod firws nyth yr aderyn y rhagwelir y bydd yn sefydlogi'r sefyllfa K4135 (17) yn dileu dyblygu firaol, ond yn syndod, cadwyd y gweithgaredd yn yr assay NMPylation in vitro (Ffigur 3D ac E a Atodiad SI, Ffigur S3 A Thablau S1–S4).Gwnaed sylw tebyg pan gyflwynwyd yr amnewidiad cyfatebol yn homolog YdiU o Salmonela typhimurium (E130A) (33).Gyda'i gilydd, mae'r data hyn yn cefnogi swyddogaeth reoleiddio'r gweddillion cadw hwn yn hytrach na'r swyddogaeth gatalytig.
Arweiniodd ailosod y gweddillion Phe a gadwyd (F4281A) o fewn yr ystod o feirws ym mharth HCoV-229E NiRAN (8) at ostyngiad mewn gweithgaredd NMPylation in vitro a gostyngiad sylweddol mewn dyblygu firws mewn meithriniad celloedd (Ffigur 3D, E ac SI) atodiad, Ffigur S3).Mae'r data yn gyson â swyddogaeth reoleiddiol bwysig y gweddillion hwn, megis y motiff DFG homologaidd Phe gweddillion a ddangoswyd yn flaenorol.Mewn kinases protein clasurol, mae'n rhan o'r ddolen rwymo Mg2+ ac yn helpu i gydosod a rheoleiddio'r asgwrn cefn???Yn ofynnol ar gyfer gweithgaredd catalytig effeithiol (32, 34).Roedd rhoi gweddillion K4116 yn lle Ala ac Arg (yn y motiff preAN), yn y drefn honno, yn dileu dyblygu firaol ac, yn ôl y disgwyl, cafodd effeithiau gwahanol ar weithgaredd NMP transferase in vitro, yn dibynnu ar y gadwyn ochr asid amino a gyflwynwyd (Ffigur 3D ac atodiadau E ac SI , Ffigur S3).Mae'r data swyddogaethol yn gyson â'r wybodaeth strwythurol, sy'n dangos bod y gweddillion hwn wedi sefydlu rhyngweithio â ffosffad ATP ( 17 ).Ym mharth NiRAN o deuluoedd firws nythu eraill, mae Lys, Arg neu His (8) yn meddiannu safle HCoV-229E pp1a/pp1ab K4116, sy'n nodi bod cyfyngiad swyddogaethol y gweddillion penodol hwn wedi'i lacio.Mae amnewid D4188A a D4283A yn dileu neu'n lleihau gweithgaredd ensymau yn gryf ac yn dileu dyblygu firws (Ffigur 3).Mae'r ddau weddillion hyn yn cael eu cadw yn y rhan fwyaf (ond nid pob un) o feirysau sy'n nythu (8), sy'n dynodi swyddogaeth bwysig sy'n benodol i'r teulu ond o bosibl yn ancatalytig.Defnyddiwyd amnewidiadau Ala o sawl gweddillion Lys ac Asp arall (K4113A, D4180A, D4197A a D4273A) nad ydynt yn cael eu cadw yn y Coronaviridae neu deuluoedd Nestioviridae eraill (8) fel rheolaethau.Yn ôl y disgwyl, mae'r amnewidiadau hyn yn oddefadwy i raddau helaeth, gyda gostyngiad bach mewn gweithgaredd ensymau ac atgynhyrchu firaol mewn rhai achosion (Ffigur 3 ac atodiad SI, Ffigur S3).Ar y cyfan, mae data mutagenesis coronafirws yn gyson iawn â data geneteg hunan-GMP a gwrthdro EAV NiRAN-RdRp (16), lle mae gweddillion EAV nsp9 (coronafeirws nsp12 ortholog) K94 (sy'n cyfateb i HCoV-229E K4135) swyddogaethau pwysig), R124 (sy'n cyfateb i R4178), D132 (sy'n cyfateb i D4188), D165 (sy'n cyfateb i D4280), F166 (sy'n cyfateb i F4281).Yn ogystal, mae data mutagenesis HCoV-229E yn gyson â data geneteg gwrthdro SARS-CoV a adroddwyd yn flaenorol (16) ac wedi'i ehangu, yr un mor debyg iawn i'r rhai a welwyd ar gyfer y motiff CN cyfatebol Phe-to-Ala mutant SARS-CoV_nsp12 The ffenoteip a ddisgrifir -F219A a HCoV-229E_F4281A (Ffigur 3 D ac E ac atodiad SI, Ffigur S3 a Thabl S1-S4).
O'i gymharu ag orthologau EAV (16), sydd â ffafriaeth glir ar gyfer UTP a GTP (yn yr adwaith hunan-NMPylation), mae ein hastudiaeth yn dangos y gall parth coronafirws NiRAN (a gynrychiolir gan HCoV-229E a SARS-CoV-2) fod yn effeithiol. trosglwyddo Pob un o'r pedwar NMP, er bod ychydig o ffafriaeth i UMP (Ffigurau 1 a 3).Mae penodoldeb cymharol isel y cyd-swbstrad NTP penodol yn gyson â'r strwythur uwchgyfansawdd SARS-CoV-2 nsp7/8/12/13 a adroddwyd yn ddiweddar, lle mae ADP-Mg2+ yn clymu i safle gweithredol NiRAN, ond nid â Rhan adenine o ffurfio rhyngweithiadau penodol (17).Yn ein hastudiaeth, nid yw'r math o niwcleotid a ddefnyddir yn yr adwaith NMPylation yn cael unrhyw effaith wahaniaethol ar weithgaredd y protein mutant (Atodiad OS, Ffigur S3), sy'n nodi nad oes gan yr un o'r gweddillion hyn gysylltiad agos â rhwymo nucleobase penodol.Mae sail strwythurol ac arwyddocâd biolegol posibl y gwahanol ddewisiadau cyd-swbstrad NTP a welwyd ym mharthau NiRAN o coronafirysau a firysau rhydwelïol i'w hastudio o hyd;gallant fod yn wir neu gallant fod oherwydd cyfyngiadau eu hastudiaethau priodol.Ar hyn o bryd, ni ellir diystyru bod gan weithgaredd NMPylator posibl y parth firws rhydwelïol NiRAN (o'i gymharu â'r gweithgaredd hunan-NMPylation a nodweddwyd yn flaenorol) ddewis cyd-swbstrad gwahanol, gan ystyried y tebygrwydd rhwng y prifwythiennol a'r coronafirws Mae parth NiRAN ar ei derfyn.Cymharu ar sail dilyniant (16).O'i gymharu â'r pseudokinase SelO, sy'n defnyddio Mg2 + fel cofactor, mae gweithgaredd coronafirws a firws rhydwelïol NiRAN yn dibynnu ar Mn2 + (16) (Ffigur 3C ac atodiad SI, Ffigur S1).Mae dibyniaeth Mn2+ a ffafriaeth amlwg tuag at UTP yn nodwedd anarferol o NMPylators protein, a dim ond yn ddiweddar y mae wedi'i gadarnhau yn y protein YdiU o Salmonela typhimurium, sy'n cataleiddio'r UMPylation gwarchodwr protein Mn2+-ddibynnol llym i amddiffyn celloedd rhag anwythiad straen Cell ATP pwll ( 33).
Mae'r tebygrwydd strwythurol a ddisgrifiwyd yn ddiweddar rhwng parth coronafirws NiRAN a kinases protein cellog (17, 19) yn darparu cefnogaeth ychwanegol i allu NiRAN i gysylltu NMP yn cofalent â phroteinau eraill yr ydym wedi adrodd arnynt yn yr astudiaeth hon.Fe wnaethom ganolbwyntio ein chwiliad am dargedau posibl NiRAN ar y proteinau a amgodiwyd gan HCoV-229E ORF1a, y gwyddys eu bod yn cynorthwyo'n uniongyrchol neu'n anuniongyrchol at atgynhyrchiad RTC wedi'i amgodio ORF1b (12, 35).Mae ein harbrofion yn darparu tystiolaeth bendant ar gyfer NMPylation effeithiol a phenodol nsp9 (Ffigur 2).Os yw'r protein targed yn cael ei ddefnyddio mewn gormodedd molar sydd 8 i 10 gwaith yn uwch na'r ensym (nsp12), cadarnheir bod nsp9 yn gyfan gwbl (mono) â NMP (Ffigur 4).Daethom i'r casgliad bod y rhyngweithio rhwng nsp12 ac nsp9 yn fyrhoedlog ac na fydd yn ffurfio cyfadeilad sefydlog gydag nsp9 (yn absenoldeb is-unedau Gwrthdrawiadau Traffig eraill).Cefnogir y casgliad hwn gan astudiaethau rhyngweithio protein ar broteome SARS-CoV (35).Nododd dadansoddiad MS mai prif amin gweddillion terfynell N nsp9 oedd y safle NMPylation (Atodiad SI, Ffigur S5).Mae ffurfio'r bond ffosfforamidad a'r grŵp amino terfynell N yn gwahaniaethu'r gweithgaredd NMPylation wedi'i gyfryngu gan NiRAN o'r adwaith AMPylation Pseudomonas syringae SelO-gyfryngol, sy'n cataleiddio ffurfio AMP sy'n gysylltiedig ag O yn Ser, Thr, neu Tyr gweddillion adduct peptid ( 22), ac mae S. typhimurium YdiU yn ffurfio adducts peptid-UMP sy'n gysylltiedig ag O-gysylltiedig (gyda Tyr).Mae'r wybodaeth gyfyngedig sydd ar gael ar y teulu SelO o broteinau yn dangos bod aelodau'r teulu protein mawr hwn yn gwahaniaethu'n fawr o ran ffurfio adion peptid-NMP.Mae hwn yn sylw diddorol sy'n haeddu astudiaeth bellach.
Arweiniodd y data a gafwyd yn yr astudiaeth hon i ni ddamcaniaethu bod NMPylation nsp9 yn gofyn am derfynfa N rhad ac am ddim.Yng nghyd-destun atgynhyrchu firaol, darperir hyn gan holltiad proteolytig y safle prosesu nsp8|nsp9 yn yr atgynhyrchiad polyprotein pp1a a gyfryngir gan Mpro a pp1ab.Yn y mwyafrif o coronafirysau, y gwahaniaeth rhwng y safle penodol hwn (VKLQ | NNEI yn HCoV-229E) a phob safle holltiad Mpro coronafirws arall yw Asn (yn hytrach na gweddill bach arall, fel Ala, Ser Or Gly) yn meddiannu P1â???Lleoliad (36).Dangosodd y data holltiad peptid a gafwyd yn yr astudiaethau cynnar fod effeithlonrwydd holltiad y safle nsp8|nsp9 yn is nag effeithlonrwydd safleoedd eraill, gan nodi 1) y gallai fod gan y safle penodol hwn rôl reoleiddiol wrth brosesu'r terfynell C mewn modd cydgysylltiedig yn amserol. pp1a rhanbarth, neu 2) a Swyddogaeth y terfynfa nsp9 N N arbennig mewn atgynhyrchu firws (37).Dangosodd ein data (Ffigur 5A) fod y ffurf ailgyfunol o nsp9 sy'n cario'r dilyniant N-terminal go iawn wedi'i NMPized i bob pwrpas gan nsp12.Tynnwyd y dilyniant ymylol N-terminal gan ffactor Xa (nsp9-His6; atodiad SI, Tabl S1) neu holltiad cyfryngol Mpro (nsp7-11-His6; Ffigur 5A ac atodiad SI, Tabl S1).Yn bwysig, dangosodd y rhagflaenydd sy'n cynnwys nsp9 heb ei dorri nsp7-11-His6 wrthwynebiad i NMPylation o nsp12, sy'n gyson â'n data, gan nodi bod y adduct nsp9-NMP yn cael ei ffurfio trwy'r amin cynradd N-terminal (Atodiad SI, Ffigur S5) .Er mwyn cael dealltwriaeth ddyfnach o benodoldeb swbstrad NiRAN, fe wnaethom ganolbwyntio wedyn ar weddillion N-terminal cyfagos nsp9.Yn absenoldeb proteinau eraill, maent yn strwythurol hyblyg, gan eu hatal rhag cael eu canfod ar ffurf heb ei labelu nsp9 (26 28, 38), gan nodi eu hamrywiad naturiol cyfyngedig Mae hyn oherwydd y dilyniant-benodol pwysig (nid yn gysylltiedig â strwythur eilaidd) swyddogaeth y darn terfynell nsp9 N.Mae amnewidiadau Ala o weddillion cadw yn y rhanbarth hwn (Ffigurau 5C a D ac atodiad SI, Ffigur S8) yn datgelu bod N3826 yn hanfodol ar gyfer NMPylation in vitro nsp9, tra bod amnewidion N3825A ac E3827A yn arwain at ostyngiad mewn NMPylation, tra nad yw amnewidiadau M3829A a P3830A yn gwneud hynny. .Yn amlwg yn effeithio ar NMPylation nsp9.Er mai dim ond effaith gymedrol y mae amnewid N-terminal Asn (N3825A, N3825S) yn ei chael ar NMPylation nsp9 ac atgynhyrchu firws mewn diwylliant celloedd (Ffigur 5C a D), dileu dilyniant gweddillion Asn o'r deupeptid N-terminal 3825-NN Mae'n angheuol i firysau, sy'n dangos bod angen un gweddill Asn cyn gweddill arall yn y N-terminus, yn ddelfrydol Asn, er ei bod yn ymddangos y gellir goddef yn rhannol amnewid gweddillion tebyg (Ffigur 5B, C, a D).Deuwn i'r casgliad bod y deupeptid 3825-NN, yn enwedig y gweddillion N3826 gwarchodedig a hanfodol o fewn yr ystod coronafirws (Atodiad SI, Ffigur S6), yn sicrhau rhwymiad a chyfeiriadedd cywir terfynfa nsp9 N yn safle gweithredol NiRAN.
Mae rhoi Ala (E3827A) yn lle Glu cadw pob is-deulu yn cadw nsp9 NMPylation in vitro ond mae'n angheuol i firysau mewn meithriniad celloedd (Ffigur 5C a D), gan nodi swyddogaeth ychwanegol y gweddillion hwn, er enghraifft, mewn rhyngweithiadau allweddol (NMPylated neu heb ei addasu ) nsp9 N-terminws a ffactorau eraill sy'n ymwneud ag atgynhyrchu firws.Ni effeithiodd treigladau Nsp9 ar y broses broteolytig o nsp9 nac unrhyw nsps cyfagos (39) (Atodiad SI, Ffigur S9), sy'n nodi nad oedd ffenoteipiau angheuol nifer o dreigladau nsp9 a arsylwyd wedi'u hachosi gan ddadreoleiddio ardal terfynell proses-proteolytig C pp1a .
Mae'r data uchod yn rhoi tystiolaeth y gall terfynfa N nsp9 gael ei UMPylated (neu ei addasu'n rhannol gydag NMP arall) ar ôl triniaeth Mpro-gyfryngol o safle holltiad nsp8|9 yn pp1a/pp1ab.Yn ogystal, arweiniodd cadwraeth ragorol terfynfa N nsp9 (gan gynnwys y gweddillion Asn unigol ac amrywiol yn y teulu coronafirws) a'r data geneteg cefn a gafwyd yn yr astudiaeth hon (Ffigurau 3E a 5D) ni i'r casgliad bod y NMPylation nsp9 a ddisgrifir yn gysylltiedig yn fiolegol ac yn hanfodol ar gyfer atgynhyrchu coronafeirws.Mae canlyniadau swyddogaethol yr addasiad hwn i'w hastudio o hyd, er enghraifft, o ran y gweithgaredd rhwymo RNA (2628) a ddisgrifiwyd yn flaenorol (amhenodol) nsp9 (ffurf heb ei addasu).Gall NMPylation N-terminal hefyd effeithio ar ryngweithio nsp9 â swbstradau protein neu RNA neu ffurfio gwahanol gynulliadau pedair lefel.Mae'r rhain wedi'u harsylwi mewn astudiaethau strwythurol a chadarnhawyd eu bod yn ymwneud yn swyddogaethol ag atgynhyrchu coronafeirws, er yn enwedig yn absenoldeb Yn achos yr addasiad hwn (26- ââ29, 40).
Er bod angen nodweddu penodoldeb targed parth coronafirws NiRAN yn fanylach o hyd, mae ein data yn dangos bod penodoldeb targed protein parth coronafirws NiRAN yn gul iawn.Er bod cadwraeth gweddillion safle gweithredol allweddol (8, 16) ym mharth NiRAN pob teulu nidovirws yn cefnogi'n gryf weithgaredd yr NMPylator gwarchodedig y proteinau hyn, mae hunaniaeth gweddillion poced rhwymo swbstrad y parth hwn Cadwraeth a chadwraeth yn parhau i gael eu nodweddu. , a gall amrywio rhwng gwahanol deuluoedd o ddibenion Nidovirales.Yn yr un modd, nid yw targedau perthnasol firysau nythu eraill wedi'u pennu eto.Gallant fod yn orthologau anghysbell o nsp9 neu broteinau eraill, oherwydd bod y dilyniannau y tu allan i'r pum parth atgynhyrchiad sy'n cael eu cadw'n gyffredinol mewn firysau nythu yn llai cadwraeth (8), gan gynnwys yr amrywiaeth genom rhwng Mpro a NiRAN, Yn eu plith, mae nsp9 wedi'i leoli yn y coronafeirws.
Yn ogystal, ni allwn ar hyn o bryd ddiystyru'r posibilrwydd bod gan barth NiRAN dargedau ychwanegol (gan gynnwys cellog).Yn yr achos hwn, mae'n werth nodi ei bod yn ymddangos bod gan yr homologau bacteriol yn y protein hwn sy'n dod i'r amlwg NMPylators (NMPylators) (30, 31) “prif reoleiddwyr”?Mae NMP yn modiwleiddio amrywiaeth o broteinau cellog i reoleiddio neu ddileu eu gweithgareddau i lawr yr afon, a thrwy hynny chwarae rhan mewn amrywiaeth o brosesau biolegol, megis ymateb i straen cellog a homeostasis rhydocs (22, 33).
Yn yr astudiaeth hon (Ffigurau 2 a 4 ac Atodiad SI, Ffigurau S3 a S5), roeddem yn gallu profi bod nsp12 wedi trosglwyddo'r rhan UMP (NMP) i un safle (cadw) yn nsp9, tra nad oedd proteinau eraill wedi'u haddasu yn y a ddefnyddir O dan yr amodau, cefnogir penodoldeb swbstrad wedi'i ddiffinio'n dda (yn hytrach na rhydd).Yn gyson â hyn, o'i gymharu â NMPylation N-terminal nsp9, mae gweithgaredd NMPylation nsp12 ei hun yn isel iawn, mae angen amser amlygiad awtoradiograffeg hirach i'w ganfod, a defnyddir cynnydd 10 gwaith yn y crynodiad nsp12.Yn ogystal, methodd ein dadansoddiad MS â darparu tystiolaeth ar gyfer NMPylation o nsp12, sy'n awgrymu bod hunan-NMPylation parth NiRAN (ar y gorau) yn weithgaredd eilaidd.Fodd bynnag, dylid nodi bod astudiaethau eraill wedi darparu tystiolaeth ragarweiniol y gall y statws hunan-AMPylation o NMPylator bacteriol reoli eu gweithgaredd NMPylation ar swbstradau protein eraill (22, 33).Felly, mae angen mwy o ymchwil i ymchwilio i effeithiau swyddogaethol posibl gweithgareddau hunan-NMPylation a adroddwyd ar gyfer EAV nsp9 (16) a coronafirws nsp12 (yr astudiaeth hon), gan gynnwys yr effaith arfaethedig tebyg i warchodwr ar blygu parth C-terminal RdRp ( 16) ).
Yn flaenorol, mae sawl rhagdybiaeth ynghylch swyddogaethau posibl i lawr yr afon parth NiRAN nidoviral wedi'u hystyried, gan gynnwys RNA ligase, guanylate transferase cap RNA a gweithgaredd preimio protein (16), ond nid yw'r un ohonynt yn gydnaws â'r swyddogaethau i lawr yr afon sydd ar gael.Mae'r wybodaeth a geir yn y swyddi a ganlyn yn union yr un pryd heb wneud rhagdybiaethau ychwanegol.Mae'r data a gafwyd yn yr astudiaeth hon yn fwyaf cyson â (ond ni all brofi) bod parth NiRAN yn ymwneud â chychwyn synthesis RNA a achosir gan brotein.Credid yn flaenorol fod swyddogaeth parth NiRAN yn 5 ??Nid yw'r rhain a Chefnogi data arall yn effeithio ar gapio ²-RNA nac adweithiau ligiad RNA.Felly, er enghraifft, ystyrir bod safle gweithredol NiRAN yn cynnwys yr Asp gwarchodedig fel sylfaen gyffredinol (D252 yn Pseudomonas syringae SelO; D4271 yn HCoV-229E pp1ab; D208 yn SARS-CoV-2 nsp12) ( OS Atodiad , ffigur 2 ).S2) (17, 22, 33), tra bod y catalysis yn yr ensym RNA ligas a chapio RNA sy'n ddibynnol ar ATP yn cael ei gynnal gan yr ensym cofalent-(lysyl-N)-NMP canolradd, sy'n cynnwys gweddillion Lys nad yw'n Newid ( 41).Yn ogystal, mae penodoldeb rhyfeddol sy'n seiliedig ar ddilyniant y coronafirws NiRAN ar gyfer targedau protein wedi'u cadw a'r penodoldeb hamddenol ar gyfer cyd-sbstradau NTP (yn ffafrio UTP) yn gwrthwynebu ensym capio cyfryngol NiRAN neu swyddogaethau tebyg i ligas RNA.
Yn amlwg, mae angen llawer o waith ychwanegol i wirio ac, os caiff ei brofi, ymhelaethu ar rôl bosibl nsp9-UMP (nsp9-NMP) mewn synthesis RNA a achosir gan brotein, a fydd yn cysylltu sawl adroddiad diddorol ond (hyd yn hyn) a adroddwyd yn flaenorol. .Arsylwadau ynysig.Er enghraifft, penderfynwyd bod diwedd yr RNA llinyn negyddol o coronafirws yn dechrau gyda llinyn oligo (U) (42, 43).Mae'r arsylwad hwn yn gyson â'r syniad bod synthesis RNA llinyn negyddol yn cael ei gychwyn trwy rwymo'r ffurf UMPylated o nsp9 i'r gynffon poly(A) (sbardunau), a all gael ei hyrwyddo gan ei rwymo RNA Y gweithgaredd a/neu ryngweithio â protein RTC arall.Yna gellir defnyddio’r gyfran UMP a ddarperir gan nsp9 fel “preimiwr” ar gyfer oligouridylation cyfryngol nsp7/8/nsp12, gan ddefnyddio’r gynffon 3??²-poly(A) yn y dilyniant RNA genomig neu oligo (A) arall sy’n cynnwys yn gweithredu fel templed, yn debyg i'r mecanwaith a sefydlwyd ar gyfer y protein VPg picornavirus (44).Beth os yw'r cynnig yn “an-normative”????Mae cychwyn y synthesis RNA llinyn negyddol (a achosir gan brotein) yn darparu cyswllt â'r arsylwadau, gan nodi bod gan yr RNA llinyn negyddol coronafirws UMP (yn lle UTP) ar ei ddiwedd (42), yr ystyrir ei fod yn nodi bod y asid niwclëig Dicer yn hollti'r diwedd ffosfforyleiddiad gan endonuclease wridin-benodol anhysbys.Os caiff ei gadarnhau, gall y gweithgaredd hydrolytig asid niwclëig hwn helpu i ryddhau'r ffurf UMPylated oligomeric o nsp9 o ben 5 ² y llinyn negatif eginol.Mae rôl bosibl nsp9 mewn preimio protein hefyd yn gyson ag astudiaethau geneteg gwrthdro blaenorol, sydd wedi dangos bod nsp9 (ac nsp8) yn rhyngweithio'n feirniadol ac yn benodol â'r elfen RNA cis-weithredol wedi'i chadw ger 3 pen y genom coronafirws.45).Yn ôl yr adroddiad hwn, gellir bellach ail-edrych ar y sylwadau blaenorol hyn a'u hehangu trwy ymchwil bellach.
I grynhoi, penderfynodd ein data weithgaredd penodol tag ensym firws nythu perchnogol sy'n gysylltiedig ag RdRp yn y N-terminus.Mewn coronafirws, defnyddir y gweithgaredd UMPylator / NMPylator hwn sydd newydd ei ddarganfod gan NiRAN i ddibynnu ar Mn2 + a gweddillion Asn cyfagos ac achosi ffurfio bondiau ffosfforamidad (ynni isel) gyda'r amin cynradd N-terminal.Trwy holltiad Mpro-mediated yn safle holltiad nsp8|9, gellir defnyddio'r targed nsp9 ar gyfer NMPylation, gan nodi'r cyplu swyddogaethol rhwng y proteas a'r parth NiRAN, sy'n ymestyn i RdRp.Mae cadwraeth gweddillion allweddol yn safle gweithredol nsp12 NiRAN a'r targed nsp9, ynghyd â data a gafwyd o ddau coronafirws gan gynnwys SARS-CoV-2, yn darparu tystiolaeth gref bod nsp9 NMPylation yn coronafirws Mae nodweddion Ceidwadol hefyd yn gam allweddol wrth ddyblygu firws.Mae'r data sydd ar gael yn ein harwain i ddod i'r casgliad bod rôl benodol ffurf NMPylated o nsp9 mewn synthesis RNA a achosir gan brotein yn senario rhesymol ar gyfer coronafirws a firysau nythu eraill, a gall NiRAN hefyd dargedu proteinau anhysbys eraill.Rheoleiddio'r firws.Rhyngweithiad gwesteiwr.Os caiff ei gadarnhau, bydd cynnwys paent preimio protein mewn synthesis RNA firaol yn cynyddu affinedd dilyniant y parthau Mpro/3CLpro ac RdRp rhwng yr uwch-grŵp coronafirws a ddarganfuwyd yn flaenorol ac uwch-grŵp tebyg i picornafeirws (9), sydd bellach wedi'u huno yn y Pisonivirites a sefydlwyd yn ddiweddar (9). 46) yn y categori.
Mae ein data hefyd yn dangos y gellir defnyddio'r gweithgareddau ensymau sylfaenol, dethol a cheidwadol a nodir yn yr astudiaeth hon fel targedau ar gyfer cyffuriau gwrthfeirysol.Gellir datblygu cyfansoddion sy'n ymyrryd â rhwymiad (ac addasiad dilynol) y terminws nsp9 N cadwedig yn safle gweithredol NiRAN yn gyffuriau gwrthfeirysol effeithiol ac amlbwrpas, sy'n addas ar gyfer trin coronafirysau anifeiliaid a dynol o wahanol (is)genws Heintiau , gan gynnwys SARS-CoV-2 a Coronavirus Syndrom Anadlol y Dwyrain Canol.
Ychwanegwyd at ddilyniant codio'r protein coronafirws a gynhyrchwyd yn yr astudiaeth hon gan RT-PCR gan ddefnyddio RNA wedi'i ynysu o Huh-7 sydd wedi'i heintio â HCoV-229E neu Vero E6 wedi'i heintio â SARS-CoV-2, a'i fewnosod gan ddefnyddio gweithdrefnau clonio safonol.pMAL-c2 (Labordy Biolegol Lloegr Newydd) neu pASK3-Ub-CHis6 (47) fector mynegiant ( OS Atodiad, Tablau S1 ac S2).Cyflwynwyd amnewidiadau codon sengl gan mutagenesis safle-gyfeiriedig PCR (48).Er mwyn cynhyrchu'r protein ymasiad MBP, trawsnewidiwyd celloedd E. coli TB1 gyda'r lluniad plasmid pMAL-c2 priodol (Atodiad OS, Tabl S1).Cafodd y protein ymasiad ei buro gan gromatograffaeth affinedd amylose a'i hollti â ffactor Xa.Yn dilyn hynny, purwyd y protein C-terminal His6-tagio gan gromatograffaeth affinedd metel Ni-immobilized (Ni-IMAC) fel y disgrifiwyd yn flaenorol (49).I gynhyrchu'r protein ymasiad ubiquitin, defnyddiodd celloedd E. coli TB1 y lluniad plasmid pASK3-Ub-CHis6 priodol (Atodiad OS, Tablau S1 a S2) ac amgodio DNA plasmid pCGI ubiquitin-benodol C-terminal hydrolase 1 (Ubp1).Trawsnewid (47).Cafodd y protein coronafirws tag Hi6-terminal C ei buro fel y disgrifiwyd yn flaenorol (50).
Perfformiwyd y prawf hunan-NMPylation o HCoV-229E nsp12-His6 fel y disgrifiwyd yn EAV nsp9 (16).Yn fyr, mae nsp12-His6 (0.5 µM) yn cynnwys 50 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)-KOH, pH 8.0, 5 mM dithiothreitol (DTT), 6 mM MnCl2, 25 µMate parodd y NTP penodedig a 0.17 µM [α32-P]NTP (3,000 Ci/mmol; Hartmann Analytic) ar 30 °C am 30 munud.Ym mhob prawf NMPylation arall (safonol) o NMPylation nsp12-mediated nsp9, caiff yr amodau adwaith eu haddasu fel a ganlyn: nsp12-His6 (0.05 µM) ac nsp9-His6 (4 µM) ym mhresenoldeb 50 mM HEPES-KOH (pH 8. ), 5 mM DTT, 1 mM MnCl2, 25 µM yn nodi NTP, a 0.17 µM yn cyfateb [α32-P]NTP.Ar ôl deori am 10 munud ar 30 ° C, cymysgwyd y sampl adwaith â byffer sampl SDS-PAGE: 62.5 mM tris (hydroxymethyl) aminomethane HCl (pH 6.8), 100 mM DTT, 2.5% SDS, 10% glyserol a 0.005% bromophenol glas.Cafodd y protein ei ddadnatureiddio trwy wresogi ar 90 ° C am 5 munud a'i wahanu gan 12% SDS-PAGE.Mae'r gel wedi'i osod a'i staenio â hydoddiant Coomassie Brilliant Blue (40% methanol, 10% asid asetig, 0.05% Coomassie Brilliant Blue R-250), wedi'i ddadliwio, ac yn agored i sgrin delweddu ffosfforescent am 20 awr (i ganfod nsp12 o NMPylation) neu (uchafswm) 2 awr (i asesu nsp9 NMPylation).Defnyddiwyd delweddwr Typhoon 9200 (GE Healthcare) i sganio'r sgrin a defnyddiwyd ImageJ i ddadansoddi dwyster y signal.
Ar gyfer dadansoddiad MS, defnyddiwyd 1 µM nsp12-His6 a 10 µM nsp9 (heb dag hexahistidine) mewn dadansoddiad NMPylation (atodiad SI, Tabl S1) a defnyddiwyd y crynodiad uwch o 500 µM UTP a GTP.Yn dibynnu ar eu crynodiad a'u hansawdd protein disgwyliedig, defnyddiwyd system HPLC Dosbarth H ACQUITY Waters gyda cholofn MassPrep (Waters) i ddad-halogi 1 i 10 µL o hydoddiannau protein byffer ar-lein.Mae'r protein wedi'i ddadhalogi yn cael ei allyrru i ffynhonnell ïon electrochwistrellu sbectromedr màs Synapt G2Si (Dŵr) trwy'r graddiant canlynol o glustog A (dŵr / 0.05% asid ffurfig) a byffer B (acetonitrile / 0.045% asid fformig), a thymheredd y golofn yw 60 ° C a chyfradd llif o 0.1 mL/min: elution yn isocrataidd gyda 5% A am 2 funud, yna graddiant llinellol i 95% B o fewn 8 munud, a chynnal 95% B am 4 munud arall.
Mae ïonau positif ag ystod màs o 500 i 5000 m/z yn cael eu canfod.Mae glu-fibrinopeptide B yn cael ei fesur bob 45 eiliad ar gyfer cywiro drifft màs yn awtomatig.Defnyddiwch feddalwedd offeryn MassLynx gydag estyniad MaxEnt1 i ddadelfennu'r sbectrwm cyfartalog ar ôl tynnu'r llinell sylfaen a llyfnu.
Treuliwyd HCoV-229E nsp9 UMPylated trwy ychwanegu trypsin wedi'i addasu gradd dilyniannu (Serva) a'i ddeor dros nos ar 37 °C.Defnyddiwyd colofn sbin Chromabond C18WP (rhan rhif 730522; Macherey-Nagel) i ddihalwyno a chrynhoi'r peptidau.Yn olaf, diddymwyd y peptid mewn 25 µL o ddŵr, a oedd yn cynnwys 5% acetonitrile a 0.1% asid fformig.
Dadansoddwyd y samplau gan MS gan ddefnyddio sbectromedr màs Orbitrap Velos Pro (Thermo Scientific).Y system nanoâ HPLC eithaf (Dionex), gyda 50 cm wedi'i osod ar y pen wedi'i deilwra??Colofn 75 μm C18 RP yn llawn gleiniau magnetig 2.4 μm (Dr. Albin Maisch Perfformiad Uchel LC GmbH) Cysylltwch â'r sbectromedr màs ar-lein trwy ffynhonnell nanospray Proxeon;chwistrellwch 6 µL o hydoddiant treuliad trypsin i mewn i ddiamedr mewnol 300 µm × ??Colofn rhag-grynhoad 1 cm C18 PepMap (Thermo Scientific).Gan ddefnyddio dŵr/0.05% asid ffurfig fel y toddydd, cafodd y sampl ei ddal yn awtomatig a'i ddihalwyno ar gyfradd llif o 6 µL/munud.
Defnyddiwyd y graddiannau canlynol o ddŵr/0.05% asid ffurfig (toddydd A) ac 80% acetonitrile/0.045% asid fformig (toddydd B) i wahanu peptidau tryptig ar gyfradd llif o 300 nL/munud: 4% B ar gyfer 5 munud, yna 30 A graddiant llinellol i 45% B o fewn munudau, a chynnydd llinol i 95% hydoddydd B o fewn 5 munud.Cysylltwch y golofn cromatograffig â nano-allyrrydd dur di-staen (Proxeon), a chwistrellwch yr eluent yn uniongyrchol i gapilari gwresog y sbectromedr màs gan ddefnyddio potensial o 2,300 V. Mae sgan yr arolwg gyda phenderfyniad o 60,000 yn y dadansoddwr màs Orbitrap yn gysylltiedig gydag o leiaf tri sgan MS/MS data, wedi'u heithrio'n ddeinamig am 30 eiliad, gan ddefnyddio daduniad a achosir gan wrthdrawiad ïon llinol neu ddaduniad gwrthdrawiad ynni uwch ynghyd â chanfod orbitrap, Y cydraniad yw 7,500.
Amser postio: Awst-03-2021